人脐血单个核细胞移植治疗裸鼠放射性卵巢早衰

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.012

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脐血单个核细胞：脐血中的单个核细胞含有大量间质干细胞、未成熟的干/祖细胞、内皮祖细胞等，可作为干细胞移植的重要来源。人脐血干细胞移植可用于治疗多种疾病，如急性心肌梗死、卵巢早衰、血管性痴呆、迟发脑病及各种妇科疾病。
卵巢早衰：是指女性在未满40岁，由于卵巢功能衰竭而导闭经、雌激素分泌下降、促性腺激素升高、不孕、围绝经期综合征的一种多病因疾病。

摘要
背景：干细胞移植成为近年来成为治疗卵巢早衰的热点之一；脐血中的单个核细胞含有大量间质干细胞、未成熟的干/祖细胞、内皮祖细胞等，可作为干细胞移植的重要来源。
目的：观察人脐血单个核细胞移植对裸鼠放射性卵巢早衰的治疗作用。
方法：将120只雌性BALB/C裸鼠随机分为4组，空白对照组不进行任何干预；模型组、静脉移植组、原位移植组进行60Coγ射线照射，0.5 Gy/d，持续30 d，建立卵巢早衰模型；造模成功后，模型组双侧卵巢注入10 µL DMEM，静脉移植组尾静脉注射10 µL人脐血单个核细胞(1×10¹³ L^-1)，原位移植组在双侧卵巢注入10 µL人脐血单个核细胞(1×10¹³ L^-1)。细胞移植30 d后，检测各组血清中雌二醇、卵泡激素、黄体生成素、抑制素B及血管内皮生长因子水平，病理观察裸鼠卵巢组织细胞凋亡及静脉移植组细胞存活情况。
结果与结论：①血清指标检测结果：与空白对照组比较，模型组雌二醇、抑制素B、血管内皮生长因子水平降低(P < 0.01)，卵泡激素、黄体生成素水平升高(P < 0.01)。与模型组比较，原位移植组雌二醇、抑制素B、血管内皮生长因子水平升高(P < 0.01)，卵泡激素、黄体生成素水平降低(P < 0.01)；静脉移植组卵泡激素、黄体生成素水平降低(P < 0.05，P < 0.01)；②细胞凋亡：与模型组比较，静脉移植组、原位移植组可有效减少颗粒细胞的凋亡(P < 0.05)；③细胞存活：人脐血单个核细胞移植后可在裸鼠卵巢中存活；④结果表明：人脐血单个核细胞移植治疗裸鼠卵巢早衰，可调节内分泌水平，抑制卵巢细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3008-1505(王毅峰)

关键词: 干细胞, 移植, 人脐血单个核细胞移植, 卵巢早衰, 生化指标, 病理切片

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell transplantation, in recent years, has become a preferred treatment for premature ovarian failure. Umbilical cord blood mononuclear cells containing a large number of mesenchymal stem cells, immature stem/progenitor cells, and endothelial progenitor cells can be used as an important source of stem cell transplantation.
OBJECTIVE: To study the therapeutic efficacy of human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation on radioactive premature ovarian failure in nude mice.
METHODS: 120 female BALB/C nude mice were randomly divided into four groups: blank control group without any intervention; model group, intravenous transplantation group, and in situ transplantation group exposed to 60Co γ rays, 0.5 Gry per day, for 30 days. After 30 days, premature ovarian failure models were made in the latter three groups. Then, nude mice in the latter three groups were given bilateral ovary injection of 10 µL DMEM, tail vein injection of 10 µL human umbilical cord blood mononuclear cells (1×10¹³/L), and bilateral ovary injection of 10 µL human umbilical cord blood mononuclear cells (1×10¹³/L), respectively. Thirty days after cell transplantation, serum levels of estradiol, follicle hormone, luteinizing hormone, inhibin B and vascular endothelial growth factor were detected, cell apoptosis in the ovary tissue and cell survival were observed pathologically.
RESULTS AND CONCLUSION: After modeling, the serum levels of estradiol, inhibin B and vascular endothelial growth factor were significantly reduced (P < 0.01), while follicle hormone and luteinizing hormone levels increased (P < 0.01). After transplantation, these indexes were all improved in the in situ transplantation group (P < 0.01), and reduced follicle hormone and luteinizing hormone levels were visible in the intravenous transplantation group (P< 0.05,P < 0.01). Compared with the model group, in situ transplantation and intravenous injection of human umbilical cord blood mononuclear cells could effectively reduce cell apoptosis in the ovary tissue (P < 0.05), and transplanted cells were able to survive in the ovary of nude mice. All these findings show human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation do have curative effects on premature ovarian failure in nude mice through the inhibition of apoptosis and the regulation of hormone secretion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Stem Cell Transplantation, Ovarian Diseases, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王毅峰，宋文广，刘淑霞. 人脐血单个核细胞移植治疗裸鼠放射性卵巢早衰[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5398-5404.

Wang Yi-feng, Song Wen-guang, Liu Shu-xia . Human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation for treatment of radioactive premature ovarian failure in nude mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(36): 5398-5404.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 120只大鼠均进入结果分析。

2.2 各组卵巢功能指标检测结果 由方差分析结果可知，空白对照组、模型组、静脉移植组、原位移植组之间比较差异极其显著(F=61.99，P < 0.0001)。与空白对照组比较，模型组雌二醇、抑制素B、血管内皮生长因子水平降低(P < 0.01)，卵泡激素、黄体生成素水平升高(P < 0.01)。与模型组比较，原位移植组雌二醇、抑制素B、血管内皮生长因子水平升高(P < 0.01)，卵泡激素、黄体生成素水平降低(P < 0.01)；静脉移植组卵泡激素、黄体生成素水平降低(P < 0.05，P < 0.01)，见表1。提示人脐血单个核细胞原位移植对卵巢早衰有一定的治疗意义，静脉移植人脐血单个核细胞对卵巢早衰也有一定意义，但与原位移植相比存在一定差异。

2.3 各组Tunel染色结果 由图1中观察可知，绿色荧光光点为凋亡细胞，在各图之中，空白对照组凋亡细胞颗粒极少；模型组荧光光点最多，表明模型组中凋亡细胞颗粒最多；与模型组相比，原位移植组、静脉移植组荧光光点较少，原位移植组凋亡细胞颗粒较静脉移植组多。

以颗粒细胞数为指标，进行统计学分析发现，各组与模型组相比都具有统计学意义(表2)，提示静脉及原位移植人脐血单个核细胞可有效减少卵巢中的颗粒细胞的凋亡，改善裸鼠卵巢功能。
2.4 移植后人脐血单个核细胞存活情况 利用免疫组化方法在裸鼠卵巢中寻找被BrdU标记的人脐血单个核细胞，发现其在裸鼠卵巢内可以定居并存活，其结果见图2。模型组裸鼠卵巢组织切片染色呈阴性，提示模型组卵巢组织中无人脐血单个核细胞；尾静脉注射组裸鼠卵巢组织切片可见经标记后的人脐血单个核细胞，表明人脐血单个核细胞在移植后可在裸鼠卵巢中存活。

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引言

卵巢早衰是指女性在未满40岁，由于卵巢功能衰竭而导闭经、雌激素分泌下降、促性腺激素升高、不孕、围绝经期综合征的一种多病因疾病^[1-4]。在40岁普通女性当中，此病每年发病率在1%-2%之间，而在原发性闭经妇女当中，发病率高达10%-28%，继发性闭经妇女中，则高达4%-18%^[5]。近年来，卵巢早衰发病率不断攀升，由于其病因复杂、治疗困难，已严重地危害妇女的身心健康。在病因方面，卵巢早衰与遗传^[6]、免疫^[7]、先天性酶缺乏^[8]、医源性因素^[9]、感染^[10]、心理等因素有关^[11]。

在遗传方面，通过对卵巢早衰患者的分析发现，约10%的患者有家族史，可表现为继发性闭经，也可表现为原发性^[12]。当今医学界普遍认为，X染色体的长臂(Xq)与短臂(Xp)区段是维持卵巢正常功能，Xp区段终端序列的缺失，是诱发早绝经或原发性闭经的重要因素，而Xq区段终端序列的缺失则是诱发卵巢早衰发生的重要因素。除了X染色体序列缺失外，相关基因上特定区段的基因突变也是卵巢早衰的重要诱因^[13]。目前，已发现的相关基因突变位点主要分布于X染色体上与常染色体上，其中X染色体上的突变位点主要有骨形成蛋白基因(突变位点在704A > G、p.Y235C及C.631C > T)、家族性智力低下1基因(突变位点在FMR1-5’端编码区的一个CGG重复扩增序列)、家族性智力低下2基因(突变位点在其外显子1中的GCC重复序列)，常染色体上的相关基因位点有生长分化因子-9基因(突变位点在C852T、A978C及c.447C>T等)、卵泡刺激素受体基因(突变位点在Asn191Ile、Ile160Thr及Arg573Cys等)、抑制素基因(突变位点在769G>A和G769A上)、脸裂狭小基因(突变位点在536C > G、772T > A及c.684-698dup15等)和叉头框03a基因(突变位点在p.A140V和 p.Y593S)^[14]。

除了遗传因素外，自身免疫也是卵巢早衰的重要诱因^[15]。研究表明，有2%-10%的卵巢早衰患者伴有原发性慢性肾上腺皮质功能减退征，此病多由自身免疫所致，可引起自身免疫性多腺体综合征^[15]。除此之外，甲状腺炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮及自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜等都是卵巢早衰患者常伴有的免疫性疾病^[16]。

在细胞免疫方面，原发性卵巢早衰与T淋巴细胞亚群有一定的相关性，但国内学者通过对比12例卵巢早衰患者与20例健康育龄妇女发现，两者外周血中的成熟T细胞总体水平一致，无统计学意义^[17]。而杨佳艳等^[18]通过研究卵巢早衰患者体内CD4⁺T淋巴细胞的Th1/Th2分布发现，卵巢早衰患者体内的Th1细胞数量占有明显优势，Th1/Th2细胞失衡是卵巢早衰患者的重要表现。在毒性T细胞CD8⁺、CD16⁺T细胞方面，王文军等^[19]研究证实，卵巢早衰患者及自然绝经妇女体内两者比值明显降低，表明卵巢早衰患者体内细胞免疫水平与绝经妇女水平相似，免疫调节处于衰老状态。调节性T细胞是一类具有控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，其中CD4⁺CD25⁺ Treg是研究进展最快、现今了解最多，也是最具代表性的细胞亚群，具有维持机体内环境稳定和自身免疫耐受的作用^[20]。谢江燕等^[21]通过对比卵巢早衰患者、DOR患者及健康人外周血中CD4⁺CD25 Treg细胞水平发现，卵巢早衰患者、卵巢储备功能减退患者与健康人相比均有显著性差异，但卵巢早衰患者与卵巢储备功能减退患者之间则没有，表明卵巢早衰的发病机制可能与卵巢的免疫反应过度，形成自身免疫性卵巢炎有关。

先天性酶的缺乏，是导致卵巢早衰的又一诱因^[4]。现已发现的与卵巢早衰相关酶有1-磷酸-半乳糖尿苷转移酶(与二磷酸尿苷-半乳糖合成有关，若缺乏，卵泡及卵巢的间质细胞会发生凋亡)、17-α-羟化酶和17-20碳链裂解酶(若妇女缺乏此两种酶，孕烯醇酮无法转化成17α-羟孕烯醇酮，导致皮质醇、雄烯二酮、雌激素、睾酮的合成减少)等^[22]。

在医源性因素方面，研究表明子宫切除、输卵管切除、卵巢子宫内膜异位囊肿剥除、放疗与化疗、子宫动脉栓塞等都是卵巢早衰的重要诱因^[23]，其机制与人体内激素分泌水平及卵巢血流量有关^[24]。卵巢早衰的致病因素复杂，致病机制不清，已成为困扰临床医生的一种严重疾病。

大多数卵巢早衰病因为特发性，目前尚无根本有效的治疗方法。在医疗技术不断发展的今天，国内外学者对卵巢早衰病因、病机及其治疗方面展开深入研究，取得了一定的进展。干细胞移植是一种新的治疗方法，尤其是脐血干细胞的应用越来越受到重视，且已在移植治疗多种疾病过程中取得了成功。脐血单个核细胞含有大量的间充质干细胞、内皮祖细胞及未成熟干/祖细胞，故脐血单个核细胞可作为干细胞移植的重要来源。实验观察人脐血单个核细胞移植治疗裸鼠放射性受损卵巢功能的恢复情况。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年4月至2015年6月在河北医科大学附属医院实验室完成。

1.3 材料

主要试剂与仪器：Hank’s试剂、PBS(实验室自配)；Ficoll-Hypaque分离液、L-DMEM培养基、5-溴-2-脱氧尿苷、雌二醇试剂盒、卵泡激素试剂盒、黄体生成素试剂盒、BrdU单抗(美国Sigma公司)；体积分数10 %小牛血清(美国Invitrogen公司)；锥虫蓝液(分析纯，天津化工)；抑制素B及血管内皮生长因子试剂盒(上海劲马生物科技有限公司)；多聚甲醛(天津光复精细化工研究所)；蛋白激酶K、凋亡检测试剂盒(德国Roche公司)。

实验动物与分组：七八周龄雌性BALB/C裸鼠120只，体质量(20±3) g，由上海斯莱克动物分公司提供，许可号：SCXX(沪)20140003，批号：20140203。饲养于SPF级饲养室，光照时间随日照时间变换，自由饮食。将120只实验裸鼠随机分为4组，每组30只，分别为空白对照组(不进行任何干预)、模型组、静脉移植组与原位移植组。

1.4 实验方法

人脐血单个核细胞的获得与标记：10份新生儿脐血来自于解放军第二军军医大学附属医院(产妇对实验知情并同意)，每份100-200 mL，产妇妊娠时间为37-40周，顺产，排除艾滋病、肝炎、梅毒等传染病及地中海贫血等家族性遗传病，血液采集使用含抗凝剂的一次性采血袋，采集完毕后使用“脐带血干细胞/祖母细胞体外分离试剂”进行体外分离，过程在6 h内完成，过程如下^[39]：取适量肝素抗凝脐带血，与等量Hank’s混合稀释，用滴管缓慢叠加在聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin) (F/H)分层液上，体积比例为2∶1，4 ℃下400×g离心离心30 min，用毛细管插入上、中层界面的白色云雾层，吸取单个核细胞，置一短管中，加入5倍体积的Hank’s液，1 500 r/min离心10 min，液洗涤细胞2次，弃去上清液，加入含体积分数10%小牛血清的L-DMEM培养基，配成悬浮细胞液，并于细胞悬液中加入BrdU进行标记。吸取一滴细胞悬液，加入一滴0.2%锥虫蓝液混合，进行细胞计数，调整细胞浓度为1×10¹³ L^-¹，置37 ℃ CO₂培养箱中孵育24 h。

动物模型的建立及分组干预：各组裸鼠饲养1周以适应饲养环境，1周后模型组、静脉移植组、原位移植组给予⁶⁰Coγ射线照射，0.5 Gy/d，持续30 d。30 d后，各组随机处死10只确定造模成功，造模成功标准见参考文献[39]。确定后，模型组裸鼠双侧卵巢注入10 µL DMEM，静脉移植组尾静脉注射1×10¹³ L^-¹人脐血单个核细胞悬液10 μL，原位移植组裸鼠双侧卵巢注入1×10¹³ L^-¹已标记的人脐血单个核细胞悬液10 µL，各组裸鼠继续正常培养30 d。

1.5 主要观察指标

卵巢功能生化指标的检测：细胞移植30 d后，4组裸鼠全部处死，断头取血，3 000 r/min离心30 min，取血清，使用ELISEA试剂盒测定卵泡激素、黄体生成素、雌二醇、抑制素B及血管内皮生长因子水平。

卵巢细胞凋亡数量观察及卵泡计算：用外科剪刀剪开裸鼠背部，各组取处死的裸鼠10只，取出左侧卵巢，用PBS洗涤，观察卵巢的大体形态，用40 g/L多聚甲醛固定，放置24 h，经梯度乙醇洗脱、透明、浸蜡、包埋等步骤制作石蜡块，切成3 µm切片，按试剂盒说明书，进行Tunel染色。石蜡切片经脱蜡水化后，滴加蛋白激酶K，室温中放置15 min，PBS洗涤3次，去除多余水分，加入Tunel反应液，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，用hochest 33324然核，晾干并用甘油封固，在荧光显微镜下观察，凋亡细胞显示绿色荧光，每个切片标本选取5个区域，每组5个样本。

标记细胞的检测：取移植两组各4只已处死裸鼠，制作卵巢组织做成石蜡病理切片，石蜡切片常规脱蜡，用蒸馏水洗涤3次后，在体积分数3%过氧化氢培养箱中室温孵育10 min，蒸馏水冲洗3次，用盐酸加胰酶法进行抗原修复，切片置于2 mol/L HCl溶液中室温孵育30 min，置于胰酶溶液中37 ℃孵育10 min，后用PBS洗涤3次，加入1∶100 抗BrdU单抗，在4 ℃冰箱中放置过夜，用PBS洗涤3次，随后用第2代广谱试剂盒测定存活的移植细胞含量。

1.6 统计学分析 数据采用STATA 11.0软件进行统计学分析，计数量以x(_)±s来表示，组间比较采用方差分析，两两比较用q 检，方差齐性分析用Bartlett检验，以P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

讨论

卵巢早衰的发病率逐年上升，近年来更有向低龄化发展的趋势^[25]。在临床上，卵巢早衰有以下诊断标准，首先患者年龄低于40岁，其次伴有烘热、潮红、失眠、记忆力减退、性欲低下等症状。在生化指标上，卵巢早衰患者体内雌二醇水平小于30 ng/L，卵泡激素大于 40 U/L，促黄体生成素大于30 IU/L，同时B超显示卵巢萎缩，无卵泡生长。患者还可伴有自身免疫性疾病的临床表现^[26]。卵巢早衰的病理机制是卵巢储备能力降低，人体体内血清中的抑制素B可通过负反馈抑制垂体合成卵泡激素，并且可抑制促性腺释放激素对自身受体的生调节作用，而血管内皮生长因子是广泛存在于人体组织中的细胞因子，在卵巢中可以起到促进卵泡生长的重要作用，二者是评价卵巢储备功能高低的指标^[27]。实验将抑制素B及血管内皮生长因子与临床上判断卵巢早衰的3个重要指标结合，可更加客观地评价裸鼠的卵巢功能，使实验具科学性及参考价值。

在卵巢早衰的治疗上，由于此病因不明，因此尚无确切且有效的治疗方案，一直以来都是困扰广大临床医师的难题。在临床上常用于卵巢早衰的治疗有激素替代疗法^[28]、免疫治疗^[4]、诱导排卵疗法^[1]、赠卵辅助技术、卵巢冷冻移植^[29]、干细胞移植^[2]、中医药治疗等^[30]。其中，由于干细胞移植具有获取相对容易、组织相容性好、致瘤风险低、具有多向分化潜能等特点，近年来成为治疗卵巢早衰的热点之一^[31]。在干细胞治疗研究中发现，人脐血干细胞的低免疫原性、易获得性，使其相对于其他干细胞具有更广泛的应用空间，脐血中的单个核细胞含有大量间质干细胞^[32]、未成熟的干/祖细胞、内皮祖细胞等，可作为干细胞移植的重要来源。人脐血干细胞移植可用于治疗多种疾病，如急性心肌梗死^[33]、卵巢早衰^[34]、血管性痴呆^[35]、迟发脑病及各种妇科疾病^[36-37]。在卵巢早衰治疗的研究中，党建红等^[34]通过制作裸鼠放射性卵巢早衰模型，对比人脐血单个核细胞移植前后裸鼠血清雌二醇、卵泡激素、黄体生成素生化指标含量，并用苏木精-伊红染色法制作病理切片，对卵巢组织进行观察。

研究在前人研究基础上，增加了血管内皮生长因子、抑制素B两个生化指标，病理组织切片使用Tunel染色法^[38]，观察卵巢组织中的细胞凋亡情况，同时将人脐血单个核细胞移植组分为静脉注射移植和原位移植两组，更好地说明不同移植方法对卵巢早衰治疗效果的影响。实验结果表明，不同的移植部位对卵巢早衰治疗有一定影响。在生化指标上，尾静脉移植人脐血单个核细胞未对裸鼠血清中的雌二醇、血管内皮生长因子及抑制素B含量有影响，对血清中黄体生成素的含量影响程度不及原位移植，表明静脉移植与原位移植在治疗效果上有所不同，原位移植各项生化指标皆优于静脉移植。而在病理切片观察中发现，静脉移植及原位移植对卵巢细胞皆有一定保护作用，卵巢组织中的细胞凋亡数量较少，而模型组中卵巢组织的细胞凋亡数量较多，提示人脐血单个核细胞抑制对卵巢早衰的作用集中体现在细胞层面上，特别是在细胞凋亡的机制上，为卵巢早衰的治疗指明方向，但卵巢早衰的机制复杂，影响因素甚多，需要进一步深入探究。在人脐血单个核细胞标记实验中发现，即使是尾静脉注射移植，裸鼠卵巢组织中依然能发现存活的移植细胞，表明虽然在治疗效果上尾静脉移植效果低于原位移植，但所移植细胞依然能到达疾病部位。静脉移植具有原位移植无法比拟的安全性与方便性，但效果不如原位移植，因此在人脐血单个核细胞移植治疗中静脉移植是否可取的，需要进一步深入探讨。